Оптимизация высокого

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 4588 (2023) Цитировать эту статью

630 Доступов

1 Цитаты

15 Альтметрика

Подробности о метриках

Для детальной оценки прямого и косвенного воздействия плановой иммунизации конъюгированной пневмококковой вакциной (ПКВ) необходимы чувствительные инструменты для выявления одновременно колонизирующихся серотипов пневмококка. Высокопроизводительный набор реакций для количественной наножидкостной ПЦР в реальном времени (Standard BioTools «Fluidigm») был разработан для обнаружения и количественного определения 92 пневмококковых серотипов в архивных клинических образцах. Для сравнения использовались мазки из носоглотки, собранные в 2009–2011 гг. у южноафриканских детей в возрасте ≤ 5 лет, предварительно серотипированные стандартными культуральными методами. Набор реакций в рамках «Fluidigm» эффективно амплифицировал все мишени с высокой эффективностью (90–110%), воспроизводимостью (R2 ≥ 0,98) и низким пределом обнаружения (< 102 КОЕ/мл). Слепой анализ 1973 образцов мазков из носоглотки показал диагностическую чувствительность > 80% и специфичность > 95% по сравнению с референтным стандартом, культуральным методом Квеллунга. Метод qPCR позволил серотипировать типы пневмококков с хорошей дискриминацией по сравнению с Quellung (ROC-AUC: > 0,73). Высокопроизводительный метод наножидкостной ПЦР в реальном времени одновременно обнаруживает 57 отдельных серотипов и 35 серотипов в 16 серогруппах в 96 образцах (включая контрольные) за один цикл кПЦР. Этот метод можно использовать для оценки влияния существующих составов ПКВ на колонизацию вакцинных и невакцинных серотипов, включая обнаружение нескольких одновременно колонизирующих серотипов. Наш метод qPCR может позволить контролировать серотип-специфическую бактериальную нагрузку, а также появление или продолжающуюся передачу второстепенных или совместно колонизирующих серотипов, которые могут иметь потенциал инвазивного заболевания.

Капсула Streptococcus pneumoniae состоит из повторяющихся полисахаридов, генетически кодируемых локусом синтеза капсульных полисахаридов (CPS), что обеспечивает гетерогенность серотипа1,2. Существует 100 биохимически и серологически различных серотипов S. pneumoniae3. Капсулярное разнообразие является важным фактором вирулентности S. pneumoniae4, а серотипы обладают разным потенциалом вызывать заболевание у человека5. Пневмококковые конъюгатные вакцины (ПКВ) предотвращают носительство пневмококкового вакцинного серотипа (VT), которое является предшественником заболевания6,7,8,9,10. Первая лицензированная PCV (PCV7) была нацелена на семь серотипов, а именно: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. В настоящее время используемые в наших условиях ПКВ включают еще три (ЦВС10: 1, 5 и 7F) и шесть (ЦВС13: 1, 3, 5, 6А, 7F и 19А) серотипов. 15- и 20-валентные ПКВ нового поколения проходят клинические испытания и включают в себя дополнительно два (22F и 33F)11 и семь (8, 10А, 11А, 12F, 15B, 22F и 33F)12 серотипов соответственно по сравнению с ПКВ13.

Наблюдение за колонизацией пневмококками верхних дыхательных путей полезно для оценки влияния иммунизации против ЦВС на популяционном уровне13. Обследования пневмококковой колонизации лучше всего проводить с использованием комплексных, чувствительных и точных методов серотипирования, способных выявить совместное носительство множественных серотипов, включая ВТ и невакцинальные серотипы (НВТ). Последовательный надзор за циркулирующими серотипами необходим для обоснования стратегий вакцинации и использования ПКВ с более высокой или альтернативной валентностью, в том числе адаптированных к различным географическим регионам; и для обнаружения новых или замещающих серотипов13.

Методы Quellung, основанные на культуре, остаются золотым стандартом серотипирования S. pneumoniae; однако эти методы требуют много времени, имеют низкую чувствительность и являются дорогостоящими14,15. По сравнению с методами, основанными на культуре, обнаружение и серотипирование на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) не зависят от жизнеспособности организма, на которую может негативно влиять использование антибиотиков, условия транспортировки и хранения проб, требуют меньше времени, обеспечивают более быструю диагностику и более высокую чувствительность15 . Использовались традиционные ПЦР и ПЦР в реальном времени, в том числе вложенные в одну пробирку и мультиплексные ПЦР с гель- или капиллярным электрофорезом в сочетании с дот-блоттингом, обогащением культуры и анализом на основе секвенирования16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. Методы ПЦР в реальном времени были разработаны с учетом растущего числа обнаруживаемых серотипов21,29,30,31, в том числе в системах с высокой пропускной способностью15,32,33. Кроме того, методы количественной ПЦР (кПЦР), валидированные для определения бактериальной нагрузки29,31,32,34, важны для оценки воздействия вакцин в программах общественного здравоохранения. Повышенная бактериальная нагрузка в носоглотке может предсказать потенциал серотип-специфического инвазивного заболевания31.

0.98, Table 1), allowing for relative quantification of bacterial load using the slope of the linear equation. The linear dynamic range for these assay-sets was at least 5-log fold. Further, Levy-Jennings plots constructed using assay-set specific reference calibrators were within ± 2.0 SD of the mean Cq value across all plates. This validated the use of the designed calibrators (gBlocks). The assay-sets for the detection of E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, the Xisco gene of S. pneumoniae and the Bacterial 16S ribosomal RNA gene (listed in Supplementary Table S1) did not perform well within this reaction-set, as the efficiency was < 90% or > 110% or r2 < 0.98 (Supplementary Table S5)./p> 80% sensitivity (Table 3) in the 1 973 archived clinical samples for 36 assay-sets. The diagnostic sensitivity for six assay-sets (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B and 35A/C/42) was lower (50–74%, Table 3) as the prevalence of the targeted serotypes detected by Quellung was ≤ 1% whereas additional targeted serotypes were detected using ‘Fluidigm’ qPCR (Fig. 3). The remaining assay-sets could not be assessed as explained above. The diagnostic specificity was high (> 95%) for all assay-sets where targeted serotypes were previously detected by Quellung (Table 3)./p> 0.05; Table 3). The ‘Fluidigm’ reaction-set was able to identify an additional 39.1% (826/2113) serotypes above those detected by culture for the compared assay-sets in Table 3, and conversely culture detected 132 (9.3% of 1419) serotypes not identified by ‘Fluidigm’ qPCR (Table 3, Fig. 3)./p> 0.98). Notably, the detection of additional serotypes (39.1%) by the ‘Fluidigm’ qPCR panel described here with 96 assay sets, is comparable to the ‘Fluidigm’ panel described previously (also 39.1%), that included 48 assay sets32. Compared with the gold-standard culture based-Quellung method, our reaction-set was 98.8% accurate for the classification of pneumococcal serotypes. Further, the average sensitivity across the qPCR reaction-set was 89.1% compared with Quellung./p>

Блог